Экспериментальная оценка влияния препарата Кагоцел на репродуктивную функцию при его введении профилактическими курсами в течение периода неполовозрелости

Введение

Противовирусные препараты относятся к числу самых востребованных лекарственных средств. Это, во многом, связано с тем, что на долю вирусной патологии приходится до 90% всех инфекционных заболеваний ¹. Снижение инфекционной заболеваемости рассматривается в настоящее время как приоритетное направление политики государства в сфере здравоохранения ². Дети являются наиболее уязвимой группой населения.

Заболеваемость у них в 3 раза выше, чем у взрослых. Считается, что дети, особенно раннего возраста, характеризуются незрелостью собственных иммунных механизмов. Способность иммунокомпетентных клеток к синтезу ИФН-альфа в ответ на проникновение вируса у детей снижена в 10 раз по сравнению со взрослыми ³. Это и определяет предрасположенность детского организма к частым вирусным инфекциям. Количество часто болеющих детей может достигать 80% от детского населения.

Кагоцел является отечественным препаратом, оказывающим противовирусное действие за счёт индукции, так называемого, «позднего» интерферона (ИФН), являющегося смесью ИФН-альфа и ИФН-бета. Препарат вызывает продукцию ИФН практически во всех популяциях клеток, принимающих участие в противовирусной защите организма (Т-В-лимфоцитах, гранулоцитах, макрофагах, фибробластах, эндотелиальных клетках). Кагоцел показал себя, как эффективное и наиболее востребованное лекарственное средство для лечения ОРВИ, гриппа, герпеса. В рандомизированных плацебоконтролируемых исследованиях показано, что он является эффективным лекарственным средством при лечении гриппа и других ОРВИ у детей ³.

Кагоцел представляет собой высокомолекулярное соединение, синтезированное на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и низкомолекулярного природного полифенола (госсипола), получаемого из растительного сырья (хлопчатника). В многочисленных исследованиях, проводимых в различных странах мира, было доказано, что госсипол проявляет противоопухолевую, антиоксидантную, иммуномодулирующую активность. Данные литературы свидетельствуют о том, что госсипол в свободном виде в определённых дозах способен подавлять сперматогенез у разных видов животных ^{4, 5}. В то же время, было доказано, что в результате молекулярных сшивок с полимерными носителями госсипол утрачивает свои токсические свойства, при этом сохраняется противовирусная и иммуномодулирующая активности ⁶. В основу технологии получения субстанции препарата Кагоцел заложен именно такой приём. Ковалентное связывание молекулы госсипола с карбоксиметилцеллюлозой — макромолекулой, традиционно применяемой в пищевой и медицинской промышленности, позволило создать эффективный и безопасный лекарственный препарат. Кагоцел® является высокомолекулярным соединением, в силу чего он практически не проникает через гистогематические барьеры, в частности, через гематотестикулярный.

При доклинических исследованиях репродуктивной токсичности Кагоцела установлено, что он не вызывает угнетения сперматогенеза, снижения плодовитости крыс-самцов репродуктивного возраста и не оказывает отрицательного влияния на их потомство ⁷. Данные литературы свидетельствуют о том, что Кагоцел при длительном (48 дней, что соответствует продолжительности всего цикла сперматогенеза) введении в дозах терапевтической (ТД) и токсических дозах крысам популяции Вистар не снижает способность животных к спариванию и оплодотворению, не угнетает сперматогенез, не оказывает токсического действия на потомство. Полученные данные характеризуют Кагоцел как препарат с широким профилем репродуктивной безопасности и свидетельствуют о том, что он может быть использован в педиатрической практике ⁸.

Не вызывает сомнения тот факт, что любое заболевание, тем более вирусное, легче предупредить, чем лечить. В настоящее время установлено, что Кагоцел является эффективными профилактическим средством вирусных инфекций у детей, обладая способностью компенсировать возрастную незрелость противовирусной защиты организма. Поскольку препарат эффективен для лечения гриппа и ОРВИ у детей и разрешён для его использования в детском возрасте, то важной является оценка его репродуктивной безопасности при использовании в осенне-весенний период регулярными профилактическим курсами у категории часто болеющих детей.

Цель исследования — экспериментальная оценка репродуктивной безопасности Кагоцела при его использовании в период неполовозрелости регулярными повторяющимися курсами.

Материал и методы

В исследовании использовали препарат Кагоцел, таблетки 12 мг (производственная серия 814/15). Эксперименты проведены на 255 белых аутбредных крысах-самцах и самках популяции Вистар, из них 165 животных в возрасте 10 дней, 90 крыс (для спаривания) в возрасте 77 дней. Распределение животных по группам представлено в табл. 1.

Животные с 10-дневного возраста (по 20 самцов и 45 самок) получали Кагоцел в дозах 6 мг/кг (эквитерапевтическая — ТД) и 60 мг/кг (высшая доза — ВД, превышающая терапевтическую дозу в 10 раз) с 10-го по 13-й, с 26-го по 29-й и с 42-го по 45-й дни жизни. Животным контрольной группы (10 самцов и 25 самок) вводили плацебо аналогичным способом в дозе, соответствующей содержанию вспомогательных веществ в высшей (60 мг/кг) дозе Кагоцела, что составляет 440 мг/кг. Все исследуемые вещества (Кагоцел, плацебо) вводили внутрижелудочно с помощью зонда один раз в день. В возрасте 2,5 мес крыс экспериментальных групп подсаживали к соответствующим партнёрам (в соотношении 1♂:2♀) на 10 дней. Для экспериментов первого этапа спаривание животных экспериментальных групп проводилось с интактными партнерами, для второго — между самцами и самками, каждый из которых получал исследуемый препарат в период их неполовозрелости. Первый день беременности определяли по наличию сперматозоидов в вагинальном мазке. По окончанию беременности высчитывался индекс фертильности животных всех групп (по отношению количества беременных крыс-самок к числу подсаженных, %). После окончания подсадки, часть самцов (n=5) и самок (n=5) всех групп подвергались эвтаназии ингаляцией СО₂. Крыс вскрывали, извлекали половые железы, фиксировали в растворе Карнуа. Готовили гистологические срезы для морфологической оценки состояния семенников и яичников, окрашивали их гематоксилин-эозином. По 5–7 беременных крыс-самок в каждой группе оставлялись до родов. Наблюдение за родившимся потомством проводили в течение 1 мес после рождения. Оценивали индекс выживаемости и динамику массы тела крысят на 4-, 7-, 14-, 21- и 28-й дни жизни. Для оставшейся части беременных крыс-самок на 20-й день беременности проводили эвтаназию методом ингаляции СО₂. Затем производили вскрытие брюшной полости и подсчитывали число жёлтых тел в яичниках, мест имплантации, живых и мёртвых плодов в матке. На основании полученных данных вычисляли показатели пре- и постимплантационной гибели эмбрионов. Плоды извлекали. Проводили их наружный осмотр, определяли распределение по полу, размер, массу тела. В дальнейшем у одной части плодов исследовалось состояние внутренних органов (по методу Вильсона), у другой — процессов оссификации (по методу Доусона) ⁹. При статистической обработке результатов за единицу наблюдения принимали средние значения для каждого помёта и данные, полученные при вскрытии одной самки. Полученные экспериментальные данные сравнивались с таковыми в контрольной группе (плацебо).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета программ Statistica 7. Результаты исследований представлены в виде среднего значения параметра и стандартной ошибки отклонения. При сопоставлении средних значений и долей в группах предварительно проводили дисперсионный анализ (метод Краскела-Уоллиса) и использовали непараметрические U критерии Манна-Уитни и углового преобразования Фишера, с оценкой различий между группами при 95% уровне достоверности.

Результаты и обсуждение

Результаты оценки показателей воспроизводящей функции крыс контрольных и экспериментальных групп представлены в табл. 2. Установлено, что индексы фертильности животных, получавших Кагоцел в ТД и ВД, не отличались от таковых в соответствующей контрольной группе. Количество жёлтых тел в яичниках, мест имплантации в матке, живых плодов, а также показатели эмбриональной гибели (пре- и постимплантационная смертность) у беременных крыс-самок экспериментальных групп статистически значимо не отличались от таковых в контроле. Полученные данные свидетельствуют о том, что субстанция Кагоцела в ВД и ТД не снижает способность к зачатию, не повышает риск самопроизвольного прерывания беременности, не вызывает в половых клетках генетических нарушений, приводящих к гибели оплодотворенной яйцеклетки.

При внешнем осмотре состояния плодов (n=726) аномалий развития обнаружено не было. Масса, размер плодов и распределение их по полу во всех исследуемых группах животных оказались сходными (р≥0,17). Количество плодов с наружными кровоизлияниями в экспериментальных группах статистически значимо не отличалось от таковых в группах контроля. Результаты оценки состояния внутренних органов и процессов оссификации плодов на 20-й день беременности представлены в табл. 3. Установлено, что у плодов контрольной группы (плацебо, n=144) выявлялись такие патологические изменения внутренних органов, как кровоизлияния в различные органы ткани, холестаз, гидронефроз, умеренное расширение желудочков головного мозга, нефроптоз, гемоперикард. В экспериментальных группах плодов (n=206) был обнаружен тот же спектр патологических изменений. Частота встречаемости отмеченных нарушений в сравниваемых группах оказалась сходной. Аномалий развития скелета у плодов (n=293) не наблюдалось. Состояние процессов оссификации плодов, судя по количеству точек окостенения плюсны, пястья, грудины, крестца, черепа в опыте и контроле, оказались сходными (см. табл. 2). Длительность беременности крыс-самок во всех группах составила 22–23 дня. Внешних аномалий развития у родившихся крысят (n=516) обнаружено не было. Индекс выживаемости и масса тела крысят экспериментальных групп во все исследуемые сроки наблюдения статистически значимо не отличались от контрольных значений (табл. 4). Полученные данные свидетельствуют о том, что введение Кагоцела в неполовозрелом возрасте крысам (самцам, самкам) в течение 3 курсов (по схеме профилактики) оказывало неблагоприятного влияния (при достижении ими репродуктивного возраста) на развитие их потомства как в антенатальном, так и постнатальном периоде.

Морфологическая картина семенников крыс, получавших Кагоцел, была сходной с таковой в контроле. Отёчности тестикулярной ткани не выявлялось, просвет сосудов не выглядел расширенным. Появления атрофированных извитых семенных канальцев не наблюдалось. Сперматогенный эпителий крыс-самцов экспериментальной группы, как и в контроле, был представлен сперматогониями, сперматоцитами, сперматидами, сперматозоидами. Истончения сперматогенной ткани не выявлялось. Просветы канальцев были свободными, слущивания гоноцитов в их просвет выявлено не было. В сперматоцитах 1- и 2-го порядка проходили активные процессы мейотического деления, о чём свидетельствовало наличие клеток с 7- и 12-й стадией мейоза. В просветах между сперматогониями как в опыте, так и в контроле, просматривались клетки Сертоли. Их клеточные мембраны не выглядели повреждёнными, что свидетельствовало о целостности гематотестикулярного барьера. Между извитыми семенными канальцами семенников всех обследуемых животных располагались интерстициальные эндокриноциты (клетки Лейдига). Большинство из них имели специфическую зернистость. Её наличие, как известно, характерно для функционально активных клеток. Морфологическая картина яичников крыс, получавших исследуемое лекарственное средство, оказалась сходной с таковой в контроле. Гемодинамических изменений обнаружено не было. В тканях желез выявлялись фолликулы, различной стадии зрелости: примордиальные, с двух- и более слоями гранулезных клеток, граафовы пузырьки. Достаточно часто можно было встретить атретические фолликулы. Отчётливо проявлялись формирующиеся жёлтые тела. Текальные оболочки не имели признаков дезорганизации. Интерстициальные клетки сохраняли свою целостность.

Таким образом, введение препарата Кагоцел крысам-самкам и крысам-самкам в неполовозрелом возрасте профилактическими курсами не вызывало патологических морфологических изменений в половых железах по достижении ими половозрелого возраста.

Выводы

Пероральное введение Кагоцела самцам и самкам крыс в течение всего периода неполовозрелости до достижения ими репродуктивного возраста в эквитерапевтической дозе (6 мг/кг) и в 10 раз её превышающей (60 мг/кг) тремя последовательными курсами с перерывами:

1. Не снижает способности животных к зачатию, не повышает риск самопроизвольного прерывания беременности, не вызывает в половых клетках генетических нарушений, приводящих к гибели оплодотворенной яйцеклетки;
2. Не оказывает токсического действия на потомство ни в антенатальном, ни в постнатальном периодах развития;
3. Не приводит к нарушению морфологического состояния половых желез.

Таким образом Кагоцел при пероральном введении не вызывает негативного воздействия на генеративную функцию животных. Введение Кагоцела периодически повторяющимися курсами на протяжении всего периода их неполовозрелости можно считать экспериментальной моделью применения препарата Кагоцела у детей раннего детского возраста (2–3 лет) и до периода полового созревания. Проведённые экспериментальные исследования могут служить доказательной базой репродуктивной безопасности применения препарата Кагоцел для профилактики гриппа и других респираторных вирусных инфекций у часто болеющих детей и подростков.

Литература/References

1. Малахов А.Б. Кондюхина Е.Г, Елкина Т.Н. Ревякина В.А. Современные аспекты профилактики респираторных инфекций у детей с атопией Лечащий врач 2007; 7: 1-3. / Malakhov A.B. Kondjukhina E.G, Elkina T.N. Revjakina V.A. Sovremennye aspekty profilaktiki respiratornykh infekcij u detej s atopiej Lechashhij vrach 2007; 7: 1-3. [in Russian]
2. Кузнецова М.А. Современные средства профилактики и лечения острых респираторных вирусных инфекций у детей. Саратовский научно-мед журн 2012; 8: 3: 803-812. / Kuznecova M.A. Sovremennye sredstva profilaktiki i lechenija ostrykh respiratornykh virusnykh infekcij u detej. Saratovskij nauchno-med zhurn 2012; 8: 3: 803-812. [in Russian]
3. Харламова Ф.С., Кладова О.В., Учайкин В.Ф. Сергеева Э.М., Нестеренко В.Г., Легкова Т.П. и др. Возможности применения противовирусного препарата Кагоцел® для профилактики и лечения гриппа и других острых респираторных инфекций у часто болеющих детей младшего возраста. Эффективная фармакотер 2012; 1: 26-34./ Kharlamova F.S., Kladova O.V., Uchajkin V.F. Sergeeva Je.M., Nesterenko V.G., Legkova T.P. i dr. Vozmozhnosti primenenija protivovirusnogo preparata Kagocel® dlja profilaktiki i lechenija grippa i drugikh ostrykh respiratornykh infekcij u chasto bolejushhikh detej mladshego vozrasta. Jeffektivnaja farmakoter 2012; 1: 26-34.
4. European Food Safety Authority. Scientific opinion. Gossypol as undesirable substance in animal feed. Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain (Question No EFSA-Q-2005-222). The EFSA Journal 2008; 908: 1-55.
5. de Peyster A., Wang Y. Genetic toxicity studies of gossypol. Mutat. Res 1993; 297: 3: 293-312.
6. An T., Ouyang W., Pan W., Guo D. , Li J., Li L. et al. Amino acid derivatives of the (-) enantiomer of gossypol are effective fusion inhibitors of human immunodeficiency virus type 1. Antiviral Res 2012; 94 (3): 276-287.
7. Рыбалкин С.П., Ковалева Е.В., Гуськова Т.А., Савинова Т.Б. Экспериментальная оценка влияния препарата Кагоцел на генеративную функцию животных. Токсикол вестник 2013; 2: 19: 33-38. / Rybalkin S.P., Kovaleva E.V., Gus'kova T.A., Savinova T.B. Jeksperimental'naja ocenka vlijanija preparata Kagocel na generativnuju funkciju zhivotnykh. Toksikol vestnik 2013; 2: 19: 33-38. [in Russian]
8. Боровская Т.Г., Полуэктова М.Е., Вычужанина А.В., Машанова В.А., Щемерова Ю.А. Экспериментальная оценка влияния препарата Кагоцел на генеративную функцию крыс-самцов пубертатного возраста. Бюллетень экспер биол мед 2017; 163: 2: 176-179. / Borovskaja T.G., Polujektova M.E., Vychuzhanina A.V., Mashanova V.A., Shhemerova Ju.A. Jeksperimental'naja ocenka vlijanija preparata Kagocel na generativnuju funkciju krys-samcov pubertatnogo vozrasta. Bjulleten' jeksper biol med 2017; 163: 2: 176-179. [in Russian]
9. Дурнев А.Д., Смольникова Н.М., Скосырева А.М., Немова Е.П., Соломина А.С., Гуськова Т.А. и др. Методические рекомендации по изучению репродуктивной токсичности лекарственных средств. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: ФГБУ НЦЭСМП; 2012; 80-93. / Durnev A.D., Smol'nikova N.M., Skosyreva A.M., Nemova E.P., Solomina A.S., Gus'kova T.A. i dr. Metodicheskie rekomendacii po izucheniju reproduktivnoj toksichnosti lekarstvennykh sredstv. Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskikh issledovanij lekarstvennykh sredstv. M.: FGBU NCJeSMP; 2012; 80-93. [in Russian]

Сведения об авторах

Боровская Татьяна Геннадьевна — д.б.н., профессор, заведующая лабораторией фармакологии репродуктивной системы НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга, Томск.
Машанова Валерия Александровна — м.н.с. лаборатории фармакологии репродуктивной системы НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга Томск.